使用半自动固相萃取对GalNAc-siRNA偶联寡核苷酸进行LC-M ...

xubin · 发表于 2023-5-8 19:46:11

　　以下研究展示了Pipette+与Otto SPEcialist相结合用于GalNAc-siRNA偶联寡核苷酸半自动液体处理和固相萃取(SPE)的能力。使用Pipette+进行液体处理，固相萃取柱使用Otto SPEcialist萃取生物样品，使用ACQUITY Premier BEH C18寡核苷酸分析专用柱、ACQUITY Premier LC系统和Xevo TQ-XS质谱仪进行后续LC-MS/MS分析和定量。

　　优势

　　使用Otto SPEcialist正压萃取装置和Pipette+进行半自动样品前处理和萃取，减少用户间差异性，保障结果准确度和重现性

　　Otto SPEcialist和Onelab软件简单易用，可轻松实现方法转换，使不同用户和不同实验室能够实施相同的前处理步骤

　　ACQUITY Premier系统和ACQUITY Premier BEH C18寡核苷酸分析专用柱搭载MaxPeak高性能表面(HPS)技术，能够减少寡核苷酸的金属吸附，进而降低方法检测限并提高重现性

　　从尿液和血浆提取物中准确灵敏地定量GalNAc-siRNA偶联寡核苷酸，LOD为1 ng/mL

　　简介

　　随着寡核苷酸药物(ONT)的相关研究和开发工作不断增加，业界愈发需要更耐用、更灵敏且选择性更佳的样品前处理和LC-MS方法来评估这些药物。由于ONT的复杂性和多样性，这类分析通常充满挑战。ONT具有多阴离子性质，能够非特异性吸附在金属表面和生物样品中的蛋白质上，进而导致分析物在生物样品前处理过程中损失，以及在LC分析过程中与金属表面结合。此外，科学家在手动制备样品时可能会出错，造成更严重的目标分析物损失1。所有这些不必要的相互作用都会导致色谱性能以及随后的质谱分析表现不佳且不一致。

　　本文所述研究介绍了各种生物基质中的GalNAc-siRNA偶联寡核苷酸(GalNAc)半自动样品前处理和萃取方法。使用Pipette+和Otto SPEcialist在混合模式弱阴离子交换吸附剂上进行样品前处理和固相萃取(SPE)，提供了一种半自动方法，可以减少人为错误并提高分析回收率。半自动样品前处理结合ACQUITY Premier LC系统和BEH C18寡核苷酸分析专用柱进行色谱分离，通过减少金属吸附来改善分析结果，最终提高GalNAc回收率。该方法实现了较高的寡核苷酸SPE回收率、低基质效应(≤10%)，并且对纯样品和萃取后加标的血浆和尿液样品实现了低浓度检测(ng/mL)。

　　实验

　　材料

　　GalNAc-siRNA偶联寡核苷酸由Alnylam Pharmaceuticals(美国马萨诸塞州剑桥)提供;寡聚脱氧核苷酸硫代磷酸酯(Gem132)由Nitto Denko Avecia(美国马萨诸塞州米尔福德)定制合成。样品前处理使用Sprague Dawley大鼠血浆(购自BIOIVT，美国纽约韦斯特伯里)或混合人尿进行。

　　样品前处理

　　用不含核糖核酸酶的水制备GalNAc和Gem132储备液，浓度为1.0 mg/mL。制备Gem132的工作储备液作内标(IS)使用，最终浓度为250 ng/mL。用流动相A制备GalNA的工作储备液，浓度为10 μg/mL，用于制备校准曲线和质控(QC)样品。用Pipette+和OneLab软件制备后加标校准曲线样品，分析的最终浓度范围为2.0-1000 ng/mL (N=2);并制备质控样品，分析的最终浓度分别为7.5、75和750 ng/mL (N=4);所有样品均用流动相A制备。在50 mM醋酸铵(pH 5.5)中，分别在低浓度10 ng/mL (N=4)和高浓度1000 ng/mL (N=4)条件下进行纯样品的回收率实验。有关使用Oasis WAX μElution SPE的SPE步骤和200 μL空白血浆液-液萃取(LLE)的预处理步骤的方案信息可参见沃特世应用纪要720007019ZH2。对于尿液的样品预处理，用50 mM醋酸铵(pH 5.5)按50:50稀释200 μL空白尿液。将SPE样品洗脱至搭载MaxPeak HPS技术的700 μL QuanRecovery 96孔板中，用硅胶PTEE盖垫覆盖，涡旋混合后提交LC-MS分析。从生物样品到分析的完整生物分析工作流程如图1所示。